293T細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中的特別注意事項(xiàng)有哪些？

 HEK-293T細(xì)胞是293T（293tsA1609neo）細(xì)胞系（ATCC CRL-11268）的衍生物。細(xì)胞持續(xù)表達(dá)SV40抗原，該細(xì)胞常用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率較高。（轉(zhuǎn)染一般以50%密度鋪板，待細(xì)胞剛剛貼到皿壁上后（一般8-10小時(shí)），即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作）

293T細(xì)胞的培養(yǎng)條件除了用DMEM（推薦iCell-0001）培養(yǎng)基；胎牛血清，10%；還要添加L-谷氨酰胺（2mM）1%；NEAA  1% ； 雙抗 1%等添加物，但是293T細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中貼壁能力較弱，在培養(yǎng)過程中特別要注意：

先，293T細(xì)胞貼壁能力較弱，培養(yǎng)時(shí)可酌情使用預(yù)鋪0.2%明膠的培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿。wan全培養(yǎng)液中需添加熱滅活胎牛血清。細(xì)胞生長(zhǎng)不能過密，過密細(xì)胞容易脫落，脫落下來的細(xì)胞可以通過離心收集，使用0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA 消化后繼續(xù)培養(yǎng)。

其次，如果發(fā)生293T細(xì)胞不貼壁，漂浮在培養(yǎng)基中的現(xiàn)象，請(qǐng)確認(rèn)所使用的DMEM中碳酸氫鈉濃度及培養(yǎng)箱中CO2濃度。并參考以下培養(yǎng)體系：

a) DMEM由1.5 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用5％CO2培養(yǎng)箱。

b) DMEM由3.7 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用10％CO2培養(yǎng)箱。

當(dāng)使用碳酸氫鈉含量高的培養(yǎng)基時(shí)，必須將這些細(xì)胞在10％CO2中孵育，以便正確緩沖培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)基沒有適當(dāng)緩沖時(shí)，239T細(xì)胞雖然可以存活，但將無法粘附并保持漂浮在培養(yǎng)基中。

293T細(xì)胞為懸浮和輕微的貼壁細(xì)胞，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤(rùn)洗后細(xì)胞會(huì)脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的wan全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3） 細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

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